بررسی فایلوژنتیک گونه لیشمانیا جدا شده از اسپیراسیون مغز استخوان بیماران کالاازاری مراجعه کننده به بیمارستان شهید فقیهی شیراز

لیشمانیوز احشایی خطرناک ترین فرم بیماری است که در صورت عدم درمان تقریبا در تمام موارد منجر به مرگ می شود. بیشتر موارد بیماری از جنوب آسیا، شرق آفریقا، خاورمیانه و آمریکای مرکزی و جنوبی گزارش می شود. در سالهای اخیر مطالعه بر روی تغییرات ژنتیکی بین گونه ای و درون گونه ای به منظور تعیین روابط فایلوژنتیک بین ایزوله ها و همچنین تعیین تغییرات اپیدمیولوژیک و منشا این تغییرات در سطح مولکولی از اولویت های تحقیقاتی سازمان بهداشت جهانی قرار گرفته است. هدف از این مطالعات در سطح علوم پایه دستیابی به نقشه تاکسونومیک موجودات بویژه در سطح گونه و زیرگونه و در سطح بهداشتی و درمانی، ایجاد دیتا بیس اولیه برای رد یابی (tracing) تغییرات اپیدمیولوژیک بیماریها بخصوص در موارد اپیدمی های آینده و کنترل آنها می باشد. اساس این مطالعات تعیین سکانس ژنهای دارای تغییرات بالا و آنالیز این تغییرات با نرم افزارهای بیواینفورماتیک برپایه الگوریتم های ژنتیکی می باشد. در مطالعه اخیر، بررسی فایلوژنتیک گونه لیشمانیا جدا شده از اسلاید های آسپیراسیون مغز استخوان بیماران لیشمانیوز احشایی در شهر شیراز به عنوان مرکز معین بهداشتی درمانی جنوب غربی کشور انجام گردید. مواد و روش کار : 31 اسلاید تهیه شده از نمونه آسپیراسیون مغز استخوان که توسط آزمایش میکروسکوپی توسط پاتولوژیست به عنوان کالا آزار تشخیص داده شده بود وارد مطالعه شد. نمونه ها برای تایید توسط متخصص انگل شناسی مجددا مورد آزمایش میکروسکوپی قرار گرفت. نمونه هاتراشیده شده و مورد تخلیص DNA قرار گرفتند. تخلیص DNA به روش فنل/کلروفرم انجام شد. DNA تخلیص شده از هر نمونه در 30 میکرولیتر آب مقطر مولکولار گرید حل و ذخیره گردید. DNA کینتوپلاستید توسط پرایمرهای 13z (5´-ACT GGG GGT TGG GTG TAA AATAG) و LiR (5´-TCG CAG AAC GCC CCT) طبق برنامه C 95 برای 5 دقیقه ابتدایی و 35 سیکل شامل C 94 برای 45 ثانیه، C 55 برای 60 ثانیه و C 72 برای 90 ثانیه و یک مرحله C 72 برای 5 دقیقه تکثیر شد. برای تکثیر قطعه ITS1 ژن ریبوزمال از پرایمرهای LITSR (5´-CTG GAT CAT TTT CCG ATG) و L5.8S(5´-TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT) استفاده شد.تکثیر لوکوس ITS1-rDNA طبق برنامه C 95 برای 5 دقیقه ابتدایی و 35 سیکل شامل C 94 برای 30 ثانیه، C 53 برای 30 ثانیه و C 72 برای 60 ثانیه و یک مرحله C 72 برای 5 دقیقه انجام شد. محصول لوکوس ITS1-rDNA جهت سکونسینگ ارسال شد. سکونسینگ توسط شرکت Bionner کره جنوبی انجام شد. به منظور آنالیز فایلوژنتیک، سکانس های ITS1 توسط نرم افزار BLAST کتابخانه ملی آمریکا (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) برای تایید گونه که قبلا توسط تکثیر ژن کینتوپلاستید انجام شده بود مورد آنالیز قرار گرفت. از نرم افزار Geneious Pro 5.5.6 برای آنالیز نوکلئوتیدی سکانس های ITS1 استفاده شد. درخت فایلوژنتیک ابر اساس متدmaximum parsimony و با کمک نرم افزار MEGA 6 تولید شد. bootstrap value برای متد maximum parsimony 1000 تکرار بود. یافته ها : از 31 نمونه 29 نمونه برای هر دو ژن تکثیر شد ولی برای 2 نمونه باند تشکیل نشد. 25 ایزوله لیشمانیا اینفنتوم و 4 ایزوله لیشمانیا تروپیکا شناخته شد. 10 هاپلوتایپ لیشمانیا اینفنتوم در این مطالعه بدست آمد. هاپلوتایپ غالب ST1 بود و 40% موارد را در برمی گرفت. ِST4، ST2وST3 به ترتیب 16%، 12% و 8% موارد را شامل شد. سایر هاپلوتایپ های ST5 تا ST10 هر کدام فقط در یک ایزوله یافت شدند. بیشتر تغییرات در 60 نوکلئوتید ابتدایی (upstream) لوکوس ITS1 رخ داده بود. بیشتر تغییرات در سکانسهای مایکروساتلایت CC، AA و TA وجود داشت. بیشترین شباهت بین ST1 و ST4 (%6/99) و سپس ST4 و ST7 و ST3 (%2/99)به ترتیب دیده شد در حالی که کمترین شباهت بین ST10 و ST8 (%7/92) و ST10 و ST6 (%93) مشاهده شد. 3 سکونس تایپ در بین 4 ایزوله لیشمانیا تروپیکا یافت شد. سکونس تایپ STA در دوایزوله و STB و STC هر کدام در یک ایزوله مشاهده شد. STA و STB شباهت بیشتری در مقایسه با STC داشتند. بر اساس توپولوژی درخت تمام سکونس تایپ های جنوب غربی (فارس، کهگیلویه و بویراحمد و بوشهر)، جنوب شرقی (کرمان) و مرکز (تهران، ساوجبلاغ و یزد) و غرب (لرستان) و برخی از ایزوله های شمال غربی ایران در کلاد یک قرار گرفتند. سایر ایزوله های شمال غربی ایران در کلاد 2 قرار گرفتند. در کلاد 1، ST1، ST3-4، ST7 و ST9-10 یک ساب کلاستر را تشکیل دادند. سکونس تایپ های مرکز، شمال غرب و ST2 از جنوب غرب در کلاد 1 در یک ساب کلاستر قرار گرفتند. ST5 و ST6 شاخه های مجزایی را بر روی کلاد 1 تشکیل دادند. دو کلاد اصلی A و B بر اساس توپولوژی درخت بدست آمده از سکانس تایپ های لیشمانیا تروپیکا ایران و غرب افغانستان مشاهده شد. بیشتر سکونس تایپ های لیشمانیا تروپیکا شامل جنوب غربی، جنوب شرقی، شرق، غرب و شمال شرق ایران و نمونه های غرب افغانستان در کلاد A قرار داشتند. بیشتر نمونه های شرق، جنوب شرق، مرکز و برخی نمونه های غرب افغانستان در موقعیت یکسانی قرار داشتند. تعدادی از سکونس تایپ های شرق ایران و غرب افغانستان یک ساب کلاستر را تشکیل دادند. همچنین ایزوله هایی از غرب و مرکز تشکیل یک ساب کلاستر را دادند. نمونه های جنوب غرب هتروژنوس ترین جمعیت را تشکیل دادند. STA، STBو یک هاپلوتایپ دیگری از جنوب غربی ایران که از نمونه پوستی قبلا گزارش شده بود در گروه اصلی کلاد A قرار گرفتند. STC و سایر هاپلوتایپ های جنوب غربی که از بانک ژن بازیابی شده بود و مربوط به بیماری لیشمانیوز پوستی بودند به همراه یک سکونس تایپ از شمال شرقی ایران در یک ساب کلاستر قرار گرفتند. کلاد B شامل بیشتر سکانس تایپ های شمال شرقی و یک نمونه از غرب ایران بود. بحث و نتیجه گیری : جمعیت لیشمانیا اینفنتوم جنوب غربی ایران هتروژنیسته بالایی را نشان دادند. بالاترین هتروژنیسیتی مربوط به جمعیت شمال غربی ایران بود. بیشترین هموژینیتی در بین ایزوله های مرکز ایران یافت شد. هتروژنیتی در بین ایزوله های لیشمانیا تروپیکای جدا شده از بیماران لیشمانیوز احشایی جنوب غربی مشاهده شد که ساختار پارافایلتیک جمعیتی آن قبلا گزارش شده است. بیشترین هموژنیتی در جمعیت های لیشمانیا تروپیکای جنوب شرقی، شرق و مرکز ایران و غرب افغانستان مشاهده شد. با توجه به نتایج سکونسینگ و مشابهت فاکتورهای اپیدمیولوژیک بیماری لیشمانیوز احشایی در شمال غربی ایران و کانون بیماری در جنوب شرقی ترکیه در همسایگی شمال غرب ایران و تایید استرین های هیبرید لیشمانیا اینفنتوم/لیشمانیا دونوانی در جنوب شرق ترکیه این احتمال وجود دارد که ایزوله های شمال غربی در کلاد 2 استرین های هیبرید باشند. جدا از کلاد 2، در کلاد 1 هتروژنیتی بیشتری در بین ایزوله های لیشمانیا اینفنتوم جنوب غربی در مقایسه با شمال غربی ایران مشاهده شد. این تفاوت با توجه به مطالعات قبلی می تواند مربوط به تفاوت در جمعیت و تعداد قبایل عشایر در دو منطقه و وجود مناطق متفاوت تر آب و هوایی در منطقه جنوب غرب نسبت به شمال غرب ایران باشد. لیشمانیا تروپیکا جدا شده از نمونه های احشایی در جنوب غرب ایران از نظر ژنتیکی تفاوتی با سایر ایزوله های لیشمانیا تروپیکا که از نمونه های پوستی از جنوب غربی ایران جدا شد نداشتند.